Сертификат анализа пептида (CoA): как читать отчёт ВЭЖХ и ЖХ-МС

Сертификат анализа (CoA, Certificate of Analysis) — лабораторный отчёт о составе образца вещества. В нём указаны метод, чистота и содержание, а графики показывают, из чего получены эти цифры. В статье разобрано, как читать такой отчёт, чем чистота отличается от содержания, почему в нём не бывает ровных 100% и какие отчёты опубликованы на сайте AG Peptides.

Что такое сертификат анализа

Сертификат анализа (CoA, Certificate of Analysis) — документ, в котором лаборатория или производитель сообщает результаты анализа образца вещества. Обычно в нём есть название образца, дата, использованные методы и измеренные показатели: подтверждение идентичности, чистота и масса вещества.

Отчёт отвечает на главный вопрос о качестве: то ли это вещество и насколько оно чистое.

Из каких полей состоит отчёт

Структура отчётов у разных лабораторий похожа. Обычно в них можно найти такие блоки:

• образец — название или код вещества и фасовки, к которым относится отчёт;
• номер партии (Lot No, Batch) — код, по которому отчёт сопоставляют с конкретной партией вещества;
• дата — когда выполнен анализ или составлен отчёт;
• метод — как получены цифры: ВЭЖХ-УФ, ЖХ-МС, анализ на азот;
• чистота — результат в процентах;
• содержание (Net content) — масса вещества в образце в миллиграммах;
• графики и подписи — хроматограмма, масс-спектр и подписи тех, кто отвечает за результат.

Чем полнее отчёт, тем проще проверить цифру: метод показывает, как она получена, а графики — из чего.

ВЭЖХ и ЖХ-МС: что измеряют эти методы

ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография, HPLC) — способ разделить смесь на компоненты. Образец растворяют и под давлением прокачивают через колонку с плотным наполнителем. Разные вещества проходят колонку с разной скоростью и выходят из неё по очереди. Детектор на выходе записывает график, где каждое вещество даёт отдельный пик.

Основы хроматографии заложил русский ботаник Михаил Цвет в начале XX века: он разделял пигменты листьев на колонке с мелом (карбонатом кальция). Слово «хроматография» он впервые напечатал в 1906 году. Современные колонки устроены иначе, но принцип тот же.

В отчётах чаще всего стоит ВЭЖХ-УФ (HPLC-UV): детектор измеряет поглощение ультрафиолета. Чистота — это доля площади главного пика в сумме площадей всех пиков на хроматограмме. В отчётах, опубликованных на сайте AG Peptides, хроматограммы записаны при длине волны 220 нм.

ЖХ-МС (LC-MS) добавляет к хроматографу масс-спектрометр, который определяет массу молекул (точнее, отношение массы к заряду, m/z). Так проверяют соответствие по массе: главный пик даёт ожидаемую молекулярную массу, а не просто выходит из колонки в то же время. Поэтому в отчёте приводят и масс-спектр: его пики должны соответствовать расчётной массе молекулы, в том числе её ионам с несколькими зарядами.

Обзор 2024 года о требованиях к характеристике пептидных препаратов (Kuril et al.) отмечает, что регуляторы ожидают набор независимых методов, а не одну цифру. Поэтому в отчётах на сайте методов несколько: ВЭЖХ-УФ, ЖХ-МС и анализ на азот.

Чистота и содержание — две разные цифры

Чистота по ВЭЖХ — относительная величина. Она показывает, какую часть всех проявившихся на хроматограмме веществ составляет основное вещество. Это не масса вещества во флаконе. Чтобы её узнать, нужно отдельное количественное измерение — содержание.

В отчётах, опубликованных на сайте, указано, что содержание определено по азоту на элементном анализаторе. В работе авторов из Фармакопеи США (USP) и британского регулятора MHRA о стандартных образцах пептидов содержание определяют отдельным расчётом по массовому балансу, а идентичность подтверждают несколькими методами: ЯМР, масс-спектрометрией и хроматографией (McCarthy et al., 2023).

Чистота и содержание отвечают на разные вопросы: первая — о доле основного вещества, второе — о его массе во флаконе. Поэтому в полном отчёте есть обе цифры, метод и графики.

Измеренное содержание не обязано совпадать с числом на этикетке до миллиграмма: это результат измерения, и читают его вместе с методом.

Почему в отчёте не бывает 100%

Чистота 99,8% — не «чуть-чуть недотянули», а результат измерения. Примеси в пептиде появляются по нескольким причинам, а ровных 100% в отчёте почти не встречается из-за предела самого метода.

• Синтез. Пептид собирают по одной аминокислоте. На каждом шаге часть цепочек получается с ошибкой, например без одного звена. После очистки таких молекул остаются следы.
• Хранение. Часть молекул со временем изменяется: окисляется или теряет амидную группу.
• Предел метода. У детектора есть порог обнаружения: примеси ниже него на хроматограмме не видны, поэтому показать «абсолютные 100%» метод не может.

Ровные 100% означают лишь, что на хроматограмме не нашлось примесей выше порога обнаружения. Это не то же самое, что их отсутствие. Такая цифра — повод внимательнее прочитать отчёт.

Что опубликовано на сайте AG Peptides

На сайте опубликованы лабораторные отчёты (ВЭЖХ-УФ и ЖХ-МС) для трёх фасовок:

• БПЦ-157 (BPC-157), 10 мг — чистота 99,85%;
• Мотс-С (MOTS-c), 10 мг — чистота 99,74%;
• НАД+ (NAD+), 500 мг — чистота 99,85%.

Отчёты открываются на страницах этих товаров, на вкладке «Сертификат». Образец в них обозначен внутренним кодом (BC10-1, MS10-1, NJ500-1). По остальным позициям каталога в карточках указана заявленная чистота — не ниже 99% по ВЭЖХ.

Что стоит сделать с любым отчётом, у кого бы он ни был: проверить образец, дату, метод, обе цифры, наличие графиков и подписей.

Частые вопросы

Что значит «99% чистоты» в сертификате анализа?

Это доля площади главного пика среди всех пиков на хроматограмме ВЭЖХ: из всего, что увидел детектор, 99% приходится на основное вещество. Массу вещества во флаконе показывает другая цифра — содержание.

Чем ВЭЖХ отличается от ЖХ-МС?

ВЭЖХ разделяет смесь на компоненты и показывает их долю по площади пиков. ЖХ-МС добавляет масс-спектрометр и определяет массу молекул в пике. Первый метод отвечает на вопрос «какую долю площади занимает основной пик», второй — «то ли это вещество по массе».

Что такое Net content в отчёте?

Это содержание: масса вещества в образце в миллиграммах. Его измеряют отдельно от чистоты. В отчётах на сайте оно определено анализом на азот. Значение может отличаться от числа на этикетке, поэтому его читают вместе с методом.

Где посмотреть отчёты AG Peptides?

На страницах товаров БПЦ-157 10 мг, Мотс-С 10 мг и НАД+ 500 мг, на вкладке «Сертификат». В каждом отчёте — методы (ВЭЖХ-УФ и ЖХ-МС), чистота, содержание, хроматограмма и масс-спектр.

Почему чистота 99,85%, а не 100%?

У любого метода есть порог обнаружения, а при синтезе и очистке пептида остаются следовые примеси. Поэтому честный результат измерения — число вроде 99,7–99,9%, а не ровные 100%.

Источники

1. McCarthy D. et al. Reference Standards to Support Quality of Synthetic Peptide Therapeutics. — Pharmaceutical Research, 2023, 40(6): 1317–1328. PMID 36949371; PMCID PMC10338602
2. Kuril A. K., Saravanan K., Subbappa P. K. Analytical considerations for characterization of generic peptide product: A regulatory insight. — Analytical Biochemistry, 2024, 694: 115633. PMID 39089363

Статья носит справочный характер: сведения взяты из опубликованных научных работ и не являются рекомендацией к применению.

Реактив для лабораторных исследований (Research Use Only). Не является лекарственным средством, БАД или косметикой. Не для употребления человеком или животными.